P-2-01 〇横田 佳奈 Kana Yokota 静岡県⽴大・薬 生体情報薬理学 心臓の正常な拍動を維持するため、交感神経刺激による心拍上昇に伴い、活動電位の持続時間は短縮する。この短縮は、βアドレナリン受容体活性化によって、心筋再分極相を形成する遅延整流性K⁺ (I_Ks)チャネル電流が増大することで制御される。I_Ksチャネルは、KCNQ1分子のホモテトラマーがカリウムイオン透過孔を形成し、KCNE1との会合によって特徴的な遅い活性化を示す。この調節機構は心筋電気活動の恒常性維持に不可欠であり、KCNQ1（LQT-1）やKCNE1（LQT-5）の変異を持つ患者では、交感神経活動亢進時に突然死リスクが高まることが報告されている。マウスやラットの心臓にはI_Ksチャネルは内因的に発現していないため、中型以上のほ乳類心室筋を用いた研究が行われてきた。これまで、我々はKCNQ1のN末端Ser27のPKAリン酸化がI_Ks電流の増大に関与することを示し、その調節にはKCNQ1 C末端のロイシンジッパー構造を介したAKAP9によるPKAとPP1の分子複合体形成が必要であり、KCNE1の会合がその過程を支えることを示した。一方、カエル卵母細胞を用いた研究では、Ser27以外のPKAリン酸化部位もI_Ks調節に関与する可能性が示唆されている。
そこで、ヒト心筋でのPKA調節機構を解明するため、αMHCプロモーターを利用し、心臓特異的にヒトI_Ksチャネル（KCNE1-KCNQ1融合分子）を過剰発現させたトランスジェニック（I_Ks-TG）モデルを作製した。さらにKCNQ1のSer27をAlaに置換した変異体（S27A KCNQ1）を導入したTG（S27A-TG）マウスを作製した。このS27A-TGマウスは、野性型TGマウスと同様、正常な生理学的状態を維持し、I_Ksチャネルの基本的な電気生理学的特性に顕著な変化は認められなかった。次に、パッチクランプした単離心筋細胞にて、イソプロテレノール刺激によるI_Ks電流の増大の程度について、野生型とS27A変異で比較検討を開始した。本実験により、KCNQ1 Ser27のリン酸化がβ-AR刺激によるI_Ks調節の作用部位であるかどうか、心筋細胞内で検討することが出来るようになった。

P-2-02 〇石山 幸樹¹、金原 和希¹、児玉 昌美¹、渡邊 泰秀¹、清水 聡史¹、永森 收志²、坂本 多穗^1,3、黒川 洵子¹ Koki Ishiyama¹, Kazuki Kimpara¹, Masami Kodama¹, Yasuhide Watanabe¹, Satoshi Shimizu¹, Shushi Nagamori², Kazuho Sakamoto^1,3, Junko Kurokawa^{1 1}静岡県大・薬・生情、²慈恵会医科大・医・SIセ、³国際医療福祉大・薬 ¹ 緩徐活性型遅延整流性カリウム（I_Ks）チャネルは、ほ乳類の心筋活動電位の再分極相を形成し、心電図QT間隔を調節する。I_KsチャネルはαサブユニットKCNQ1とβサブユニットKCNE1から構成され、その機能喪失変異は先天性QT延長症候群を引き起こす。これまで、我々は、ヒトI_Ksチャネル（hKCNE1とhKCNQ1の融合タンパク質）を心臓特異的に発現させた遺伝子改変（I_Ks-Tg）マウスを作製し、その生理学的意義を解析してきた。以前に行ったI_Ks-Tgマウス心室筋組織のプロテオーム解析により、PKAやNOシグナル関連分子に加え、細胞内Ca²⁺などの敗血症関連シグナル分子との相互作用が明らかになった。COVID-19による敗血症患者の解析では、抗菌薬とは関連しないQT延長型不整脈が敗血症性心筋障害の一つとして報告された。これらの背景から、本研究では敗血症病態におけるI_Ksチャネルの役割解明を目的とした。　
実験には、α-MHCプロモーター制御下にヒトI_Ks融合タンパク質を心臓特異的に発現するI_Ks-Tgマウス（雄性、14週齢）を用いた。敗血症モデルは、野生型C57BL/6J雄性マウスの糞便懸濁液を腹腔内投与することで作製した。投与量は、4日間で野生型マウスが40-60%生存する量に調整した。In vivo解析では、生存率、敗血症スコア、および体表面温度を経時的に比較した。その結果、I_Ks -Tgマウスは野性型マウスに比べ、死亡率が低く、体表面温度の低下も軽度であった。また、糞便懸濁液投与24時間後の敗血症スコアは、I_Ks-Tgマウスで有意に低い値を示した。次に、In vitro解析として、糞便懸濁液投与24時間後に摘出した心臓から単離した心室筋細胞を用いて、Ca²⁺蛍光指示薬によるCa²⁺動態解析を行った。生理学的条件下では、野性型およびI_Ks -TgマウスのいずれにおいてもCa²⁺ transient波形に有意な変化は見られなかった。一方、isoproterenolによるβアドレナリン受容体刺激に対する細胞応答性は、野生型に比べI_Ks -Tgマウスで減弱していた。
以上の結果から、心筋I_Ksチャネルは敗血症病態に対して保護的に機能することが示唆された。今後は、敗血症病態における心臓のβ刺激応答性やCa^２+動態変化との関連を含め、保護作用の詳細な分子メカニズムの解明を進める必要がある。

P-2-03 〇吉岡 健人、小原 圭将、駱 一林、洪 強昊地、藤原 彩香、木南 若葉、小澤 英晃、田中 芳夫 Kento Yoshioka, Keisuke Obara, Yilin Luo, Qianghaodi Hong, Ayaka Fujiwara, Wakaba Kinami, Hideaki Ozawa, Yoshio Tanaka 東邦大・薬・薬理 　フェルラ酸 (FA) は米ぬかやコーヒーなどに含まれるポリフェノールで、抗酸化作用・抗炎症作用・紫外線吸収作用などを有するほか、心血管関連疾患に対しても予防・改善効果を示す可能性が報告されている。その根拠として、ラット摘出血管標本を用いた実験から、FAの血管収縮抑制作用に電位依存性Ca²⁺チャネル (VDCC) の抑制が関与する可能性が報告されている。本研究では、FAが冠動脈収縮を抑制する可能性とその機序を明らかにする目的で、ブタ冠動脈及びラット胸部大動脈由来A7r5細胞を用いた検討を行い、以下の結果を得た。① FA (3 × 10⁻⁴–3 × 10⁻³ M) は冠攣縮誘発物質［アセチルコリン、ヒスタミン、セロトニン、U46619 (トロンボキサンA₂誘導体)、プロスタグランジンF_2α (PGF_2α)、エンドセリン-1 (ET-1)］およびhigh-KClによるブタ冠動脈の収縮反応を濃度依存的に抑制した。② FAは、A7r5細胞においてhigh-KClによる細胞内Ca²⁺ 濃度の上昇を抑制した。③ FA (3 × 10⁻³ M) とジルチアゼム (3 × 10⁻⁵ M) の収縮抑制作用を比較すると、非受容体刺激（high-KCl）による収縮に対してはFAのほうがジルチアゼムより弱かったが、受容体刺激による収縮に対してはFAのほうがジルチアゼムより強かった。④ FA (3 × 10⁻⁴–3 × 10⁻³ M) は、Ca²⁺ free + 0.2 mM EGTA 溶液中において、ET-1 (10⁻⁸ M) およびNaF (10⁻² M) によって誘発される収縮反応を濃度依存的に抑制した。これらの収縮は、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬であるML-7 (10⁻⁴ M) によって完全に抑制された。⑤ FA (3 × 10⁻³ M) は、A7r5細胞においてNaF (10⁻² M) によるミオシン軽鎖のリン酸化を抑制した。以上の結果から、FAが冠攣縮誘発物質によるブタ冠動脈の収縮を強力に抑制することが明らかとなり、FAの摂取が冠攣縮予防に寄与する可能性が示唆された。また、FAの冠動脈収縮抑制作用には、VDCCを介したCa²⁺流入の抑制のほか、細胞外Ca²⁺流入によらないミオシン軽鎖リン酸化に関連する機構の抑制が関与している可能性が示された。

P-2-04 〇加藤 健一¹、梶岡 俊一²、山﨑 純³、内田 邦敏⁴ Kenichi Kato¹, Shunichi Kajioka², Jun Yamazaki³, Kunitoshi Uchida^{4 1}福岡医療専門学校、²国際医療福祉大学薬学部、³日本大学生物資源科学部獣医学科、⁴静岡県立大学食品栄養科学科 ¹ ラット肺細動脈におけるUTP依存性の反応を調べた。コラゲナーゼ酵素処理で得られた平滑筋細胞に対する免疫染色法により、ANO1、P2Y₂、P2Y₆、およびIP₃Rの発現が認められた。単離平滑筋細胞にアムホテリシンBを用いた穿孔ホールセル・パッチクランプ法の実験から、UTP（100 mM）により大きな内向き電流とそれに続くオシラトリーな内向き電流が生理的な細胞外液（PSS）中において観察された。このUTP依存性のオシラトリーな内向き電流は、niflumic acid（100 mM）やMONNA（ANO1特異的な抑制剤、10 mM）の投与により抑制されたため、Ca²⁺依存性Cl^-チャネル、特にANO1が関与していることが強く示唆された。膜透過性のIP₃Rブロッカーである2APB（50 mM）とXestospongin C（20 mM）の投与により、UTP依存性のオシラトリーな内向き電流が減弱した。また、Fura-2を用いた細胞内Ca²⁺濃度測定法により、2APBはUTP依存性の細胞内Ca²⁺応答も抑制した。ホールセル・パッチクランプ法により、GTPbS（0.5 mM）、あるいはheparin（5 mg/mL）を細胞内投与したところ、UTP依存性の応答が消失した。興味深いことに、ホスホリパーゼ-Cの抑制剤であるU-73122（5 mM）、及びホスホリパーゼ－Cの活性剤であるm-3M3FBS（30 mM）のどちらもこの反応を抑制した。m-3M3FBSはHEK293細胞に発現させたANO1チャネルに対して、抑制効果はほとんど示さなかった。また、U-73122とm-3M3FBSのどちらもUTP依存性収縮を抑制した。以上の結果から、UTP依存性の電流反応はANO1(TMEM16A)チャネルを介したものであり、ホスホリパーゼ－Cの抑制剤も活性剤もUTP依存性電流および収縮反応を抑制するという結果を得た。

P-2-05 〇里村 明梨、永澤 悦伸、相本 恵美、高原 章 Akari Satomura, Yoshinobu Nagasawa, Megumi Aimoto, Akira Takahara 東邦大・薬・薬物治療学 【背景と目的】我々は、心血管系作用薬による薬理学的負荷が、大動脈領域と大腿動脈領域で異なる血管弾性の機能的変化を惹起し、特に大腿動脈領域では、被検薬物の血管平滑筋に対する収縮・弛緩作用を反映することを明らかにした。本研究では、輸液投与による容量負荷が、血行動態および血管弾性に与える影響とそれに対する内因性一酸化窒素（NO）の関与を明らかにすることを目的に、人工代用血漿製剤Voluven^Ⓡの静脈内投与による血管内血液量の増加が血管弾性指標に与える影響を、NO合成酵素阻害剤L-NAMEの非存在下および存在下で比較検討した。
【方法】イソフルラン麻酔下のNZWウサギより心電図、心音図ならびに総頸動脈と大腿動脈の血流量、中心静脈圧（CVP）を記録した。右上腕動脈、左総腸骨動脈起始部および右腓骨動脈の血圧を同時測定し、大動脈分岐部を境界点とした大動脈領域と大腿動脈領域の区間毎の脈波伝播速度を臨床で確立しているCAVI測定法に準じて測定し、血管弾性指標であるβ値を領域別（aortic βとfemoral β）に求めた。麻酔ウサギにVoluven^Ⓡを、1、2、および5 mL/minの流速でそれぞれ10分間静脈内投与し、投与開始30分後までの各指標の変化を、L-NAME（50 mg/kg）非存在下および存在下で観察した。
【結果】Voluven^Ⓡの投与は、L-NAME存在下および非存在下のいずれでもCVPを上昇させ、血圧に影響を与えなかった。このとき、総頸動脈および大腿動脈の血流量が増加し、L-NAME存在下における血流量の増加幅は、非存在下と比較していずれも小さかった。L-NAME非存在下においてVoluven^Ⓡの投与によりaortic βは低下したのに対し、L-NAME存在下では変化を示さなかった。一方、L-NAME非存在下で、Voluven^Ⓡ投与時に変化が見られなかったfemoral βは、L-NAME存在下で上昇した。
【結論】Voluven^Ⓡの静脈内投与による容量負荷は、大腿動脈領域の血管弾性には影響しない一方で、大動脈領域の血管弾性を上昇させ、両者の過程には内因性NOが関与していることが明らかとなった。加えて容量負荷時における総頸動脈および大腿動脈血流量の調節に、内因性NOを介した大動脈領域の血管弾性の変化が一部関与する可能性が推定された。

P-2-06 〇山口 卓哉、上田 直斗、山﨑 純 Takuya Yamaguchi, Naoto Ueda, Jun Yamazaki 日本大・生物資源科学・獣医薬理 【背景・目的】 　カルシウムイオン透過性の陽イオンチャネルである Transient Receptor Potential (TRP) M2は、炎症時に産生される過酸化水素 (H₂O₂) などの活性酸素種 (ROS) によって活性化される。ヒトやマウスの単球において、TRPM2 の活性化は炎症性サイトカインの産生を促進することから、TRPM2 は単球が関与する炎症応答の制御における分子標的の一つと考えられている。我々は、イヌの単球を多く含む末梢血単核球 (PBMC) において TRPM2 遺伝子の発現を確認し、さらに、イヌ TRPM2 を強制発現させた細胞に H₂O₂ を作用させると細胞外からの Ca²⁺ 流入による細胞内 Ca²⁺ レベルが上昇することを明らかにしてきた。本研究では、イヌ PBMC を用いて、TRPM2 への刺激が炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。 【材料・方法】 　イヌ PBMC をガラス片上に播種し、接着した細胞に対してカルシウムイメージングを行い、H₂O₂ および TRPM2 選択的阻害薬 JNJ-28583113 に対する応答を評価した。さらに、培養皿に播種・接着させたイヌ PBMC を、単球・マクロファージにおいて ROS の産生を誘導する Zymosan とともにインキュベートし、炎症性サイトカイン遺伝子の発現変化を RT-qPCR 法により解析した。細胞内 ROS レベルの変化は蛍光プローブ DCFH-DA を用いて評価した。 【結果・考察】 　イヌ PBMC に H₂O₂ を作用させたところ、細胞内 Ca²⁺ レベルが上昇し、この反応は TRPM2 阻害薬によって抑制された。次に、PBMC を Zymosan とともにインキュベートしたところ、細胞内 ROS レベルの上昇と、IL-1b などの炎症性サイトカインの遺伝子発現量の増加が認められた。同様の実験を TRPM2 阻害薬存在下で行ったところ、Zymosan による細胞内 ROS レベルの上昇には影響を及ぼさなかった一方で、炎症性サイトカイン遺伝子の発現上昇は抑制された。また、この炎症性サイトカイン遺伝子の発現上昇は、細胞内 Ca²⁺ キレート剤である BAPTA-AM によって抑制された。 　以上の結果から、イヌ単球において、 ROS によって TRPM2 が活性化され、これに伴う細胞内への Ca²⁺ 流入を介して炎症性サイトカインの産生が亢進されることが示唆された。

P-2-07 〇八角 佳毅^1,2、的場 大周^1,2、白幡 響稀^1,2、野中 美希²、大島 佳織^2,3、唐木 文霞¹、藤井 秀明¹、上園 保仁² Yoshiki Hakkaku^1,2, Daishu Matoba^1,2, Hibiki Shirahata^1,2, Miki Nonaka², Kaori Oshima^2,3, Fumika Karaki¹, Hideaki Fujii¹, Yasuhito Uezono^{2 1}北里大・薬・生命薬化学、²東京慈恵会医科大・医・疼痛制御、³東京大学大学院医学系研究科病因・病理学 ¹ 【目的】
医薬品の開発には、標的となる受容体やイオンチャネルに結合するリガンドが必須である。我々は汎用性が高い創薬候補化合物ライブラリーの創出に取り組んでいる。ここで構築した小規模な化合物ライブラリーを対象としたリガンドスクリーニングを行い、実際にリガンドを見出すことを本研究の目的とした。
【方法】
構築したライブラリーの構成要素である22化合物（SYK-783、784、785、788、789、790、791、810、811、857、858、860、1312、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329）について、オキシトシン受容体、オレキシン1受容体およびTransient Receptor Potential (TRP)チャネル（Vanilloid 1（V1）、Ankyrin 1（A1）、Melastatin ８（M8）の3種類）に対する作動活性をHuman embryonic kidney 293 (HEK293)細胞に安定発現させた細胞を用いて評価した。ここでの評価には受容体およびイオンチャネルの活性をリアルタイムで測定できるCellKey™アッセイシステムを使用した。このスクリーニングの結果、有意な作用を示した化合物についてはカルシウム（Ca²⁺）イメージングも実施した。
【結果】
CellKey™アッセイシステムを用いたスクリーニングでは、SYK-1322とSYK-1329の2化合物がTRPM8に対して活性を示した。2つの化合物を用いてCa²⁺イメージングを行ったところ、TRPM8への作用はSYK-1322のほうがSYK-1329よりも強いことが判明した。
【考察】
今回構築した22化合物はいずれもTRPM8の作動薬であるボルネオールに類似した二環性骨格を有している。活性が認められたSYK-1322はヒドロキシ基をもち、TRPM8作動薬であるボルネオールやメントールもヒドロキシ基をもつ化合物であることから、二環性骨格に加えて、ヒドロキシ基がTRPM8の活性発現に寄与していると考えられた。22化合物のうちヒドロキシ基をもつ化合物にはSYK-1321、1328があるが、この2化合物はSYK-1322と異なる部位にヒドロキシ基があり、活性を示さなかった。このことから、TRPM8の活性作用にはヒドロキシ基の向きも重要であると考えられる。SYK-1329にはヒドロキシ基がないものの、有意な活性が確認された。SYK-1329は他の化合物と比べて一炭素増炭された構造であるため、その構造がTRPM8の活性作用につながった可能性が示唆される。今後より詳細な構造活性相関研究を行い、活性発現のメカニズムを明らかにしていく。