C-2-1 〇松田 美琉人、千田 有希乃、関川 直己、久世 友、遠藤 優衣、今中 俊輝、森﨑 祐太、三澤 日出巳 Miruto Matsuda, Yukino Chida, Naoki Sekigawa, Yu Kuse, Yui Endo, Toshiki Imanaka, Yuta Morisaki, Hidemi Misawa 慶応義塾大・薬・薬理 　掻痒は「掻きたいという衝動を引き起こす不快な感覚」と定義され、アトピー性皮膚炎（AD）やドライスキンでは慢性的な掻痒が患者のQuality of life (QOL) を著しく低下させる。現在の治療薬は皮膚抗炎症作用を目的としたステロイド外用薬やJanus kinase (JAK) 阻害外用薬などが用いられるが、掻痒そのものに対する効果は部分的である。掻痒の要因として、神経成長因子（NGF)による表皮近傍への一次感覚神経終末の伸長および痒み刺激への感受性増加が考えられている。一次感覚神経の細胞体が存在する後根神経節（DRG）は、痒み信号を末梢から中枢神経系へ中継する重要な部位である。そこで我々はDRGに着目し、複数の掻痒モデルマウスにおけるDRGの遺伝子発現変動を網羅的に解析することで、慢性掻痒における新規掻痒関連因子の探索を行った。 　 　 　
　掻痒モデルマウスとしてAD自然発症モデルマウスであるNc/Ngaマウス、2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) 反復塗布ADモデルマウス、AEW (アセトン・エーテル・水塗布）ドライスキンモデルマウスを用いた。これら3つの異なる慢性掻痒モデルにおけるDRGの遺伝子プロファイルをマイクロアレイ法により比較解析したところ、Fizz1 mRNA発現が共通して低下していた。 　 　 　
　Fizz1はIL-4、IL-13により発現が誘導されるサイトカインであり、抗炎症型マクロファージのマーカーとして知られている。DRGでの免疫組織染色の結果、Fizz1はマクロファージではなくニューロンに発現していることが明らかとなった。続いてDRGニューロンの初代培養系を用いた機能解析により、Fizz1はNGFによる神経突起伸長および分岐形成を抑制することが明らかとなった。さらに、DNFB反復塗布ADモデルマウスにreconbinant-Fizz1タンパク質を皮下投与したところ、Fizz1投与群では対照群と比較して掻破回数の持続的な減少がみられた。 　 　
　以上より、慢性掻痒モデルマウスではDRGにおけるFizz1の発現が低下しており、Fizz1がNGFによる神経突起伸長を抑制する機能を有することが明らかとなった。また、recombinant-Fizz1投与による掻破行動の抑制効果から、Fizz1は慢性掻痒に対する新規治療標的として期待される。

C-2-2 〇山口 晴滉¹、岡本 悠¹、成田 道子²、須田 雪明^1,2、関口 裕太¹、濱田 祐輔^1,2、南雲 康行²、斉藤 毅³、長瀬 博³、石氏 陽三⁴、葛巻 直子^1,2、成田 年^1,2 Haruaki Yamaguchi¹, Yu Okamoto¹, Michiko Narita², Yukari Suda^1,2, Yuta Sekiguchi¹, Yusuke Hamada^1,2, Yasuyuki Nagumo², Tsuyoshi Saito³, Hiroshi Nagase³, Yozo Ishiuji⁴, Naoko Kuzumaki^1,2, Minoru Narita^{1,2 1}星薬大・薬・薬理、²国立がん研セ・がん患者病態生理、³筑波大・睡眠研究機構（IIIS）、⁴東京慈恵会医科大・皮膚科学 ¹ 　オピオイド受容体は全身に広く発現しているが、エンケファリンやダイノルフィンなどの内因性オピオイドとの高い親和性を有することから、視床下部や脊髄を含む中枢神経系における機能が、疼痛や掻痒治療の標的として注目されている。しかしながら、末梢におけるオピオイド受容体の生理的・病態的意義は十分に解明されていないのが現状である。本研究では、活性化型ビタミン D3 誘導体である MC903 の反復塗布によりアレルギー性皮膚炎モデルマウスを作製し、各種選択的作動薬、末梢選択的作動薬および拮抗薬の痒み関連行動に対する影響について検討を行った。その結果、末梢選択的μ受容体拮抗薬および末梢選択的κ作動薬によっては、自発掻破回数および触刺激に対する痒み過敏反応 (アロネーシススコア) に有意な変化は認められなかった。一方、中枢移行可能な選択的κオピオイド受容体作動薬は、自発掻破回数およびアロネーシススコアを有意に抑制させた。これらの結果より、脳内あるいは脊髄のκオピオイド受容体を刺激することで、痒み反応を抑制する可能性が示唆された。さらに、中枢移行性κオピオイド受容体作動薬を投与したアレルギー性皮膚炎モデルにおける脾臓内免疫細胞の解析を行った結果、CD8 陽性 T細胞数に大きな変化は認められなかったものの、抑制性免疫チェックポイント受容体を高発現した CD8 陽性 T 細胞の割合はκオピオイド受容体作動薬投与により有意に抑制された。以上より、選択的κオピオイド受容体作動薬は中枢内κオピオイド受容体を介して痒み反応を抑制するだけでなく、アレルギー性皮膚炎で惹起される免疫機能低下に対する改善効果を有する可能性が示唆された。

C-2-3 〇日置 優花^1,2、飯塚 佳子^3,4、前花 祥太郎^3,5、久保 誠^3,5、市川 尊文^2,3、小島 史章^1,2,3 Yuka Hioki^1,2, Yoshiko Iizuka^3,4, Shotaro Maehana^3,5, Makoto Kubo^3,5, Takafumi Ichikawa^2,3, Fumiaki Kojima^{1,2,3 1}北里大・医衛・薬理、²北里大・院医療・生体制御生化、³北里大・医衛・再生医療細胞デザイン研、⁴北里大・院医療・食予防医科、⁵北里大・院医療・環境微生物 ¹ 乾癬（かんせん）は全身に皮膚の肥厚や鱗屑症状を伴う難治性の慢性炎症性疾患である。本疾患の背景には免疫異常が関わるとされているが、病態形成機序の詳細は未だ解明されておらず、病態形成機構に基づく新規治療法の確立は急務である。近年、乾癬患者の皮膚病変部位においてプロスタグランジン(PG)E₂生合成系の最終酵素である膜型PGE合成酵素-1(mPGES-1)が高発現することが報告されたが、その発現意義や役割の詳細は不明である。そこで本研究では、乾癬におけるmPGES-1の役割の詳細を明らかにすることを目的として、ヒト乾癬病態に類似した症状を呈することで知られるイミキモド（IMQ）誘発乾癬病態モデルならびにmPGES-1欠損マウスを用いて検討を行った。IMQ投与後6日目の野生型マウスの皮膚ではmPGES-1のmRNAおよび蛋白質の発現増加を認め、最終産物であるPGE₂産生量は著しく増加していた。一方、mPGES-1欠損マウスではPGE₂産生量が著しく減少していたことから、mPGES-1が皮膚におけるPGE₂産生の大部分を担っていることが明らかになった。さらに、IMQ投与後のmPGES-1欠損マウスの皮膚では、乾癬の主症状である皮膚の肥厚および鱗屑症状の増悪を認め、組織学的にも皮膚の顕著な肥厚を認めた。このことからmPGES-1が乾癬病態に対して保護的に働く可能性が示唆された。次いで皮膚免疫に焦点を当て解析を行ったところ、mPGES-1欠損マウスの皮膚では乾癬増悪因子であるインターロイキン（IL）-17AのmRNA発現が亢進し、IL-17Aを産生するTCRgammadelta陽性細胞が著しく増加していた。そこで、中和抗体を用いてin vivo で特定の免疫担当細胞を枯渇した条件下での病態評価を行った。結果、抗TCRgammadelta抗体の投与によるTCRgammadelta陽性細胞枯渇条件下において、mPGES-1欠損マウスで認める乾癬病態の増悪は野生型マウスと同程度にまで軽減した。本研究によって、mPGES-1/PGE₂系は乾癬増悪因子IL-17Aに関連したT細胞免疫系を抑制的に制御することで、乾癬病態に対して保護的に働く可能性が示唆された。

C-2-4 〇水野 真孝、山口 卓哉、山﨑 純 Masataka Mizuno, Takuya Yamaguchi, Jun Yamazaki 日本大・生物資源科・獣医薬理学 　クッパー細胞 (KCs) は肝臓の組織常在性マクロファージであり、機能的特徴の異なる２つの亜集団、すなわち、サイトカイン産生能が高い CD11b⁺ KCs および貪食能が高い CD68⁺ KCs に分類される。肝臓の炎症性病態では、活性酸素種 (ROS) などの酸化ストレスによって CD11b⁺ KCs における炎症性サイトカイン産生が亢進し、病態の悪化を引き起こすことが示されている。Transient Receptor Potential Melastatin 2 (TRPM2) は ROS 感受性の Ca²⁺ 透過性カチオンチャネルであり、マウスの骨髄由来マクロファージでは過酸化水素 (H₂O₂) 刺激に応答して炎症性サイトカイン産生が亢進することが知られている。我々はこれまでに、マウスのクッパー細胞では CD11b⁺ KCs のみにおいて TRPM2 の発現が高いことを見出している。そこで本研究では、クッパー細胞の CD11b⁺ KCs における ROS 刺激に応答した炎症性サイトカインの産生亢進に、TRPM2 が関与していることを明らかにするため、マウスのクッパー細胞亜集団を用いた解析を行った。
　C57BL/6J (野生型) マウスおよび TRPM2 KO マウスの肝臓から CD11b⁺ KCs および CD68⁺ KCs をセルソーターにより分取した後、マクロファージにおいて ROS 産生を誘導するザイモザンと共にインキュベートし、炎症性サイトカイン遺伝子の発現変化を RT-qPCR 法で調べた。また、野生型マウスの各亜集団については TRPM2 選択的阻害剤である JNJ-28583113 あるいは細胞内 Ca²⁺ キレート剤である BAPTA-AM を用いて同様の実験を行った。
　野生型マウスから分取した CD11b⁺ KCs では、IL-1a, IL-1b ならびに CXCL-2 の各遺伝子発現がザイモザン刺激によって上昇した。一方で、CD68⁺ KCs ではザイモザン刺激を行ってもこれら遺伝子の発現は上昇しなかった。CD11b⁺ KCs におけるザイモザン刺激に応答した炎症性サイトカイン遺伝子の発現上昇は、TRPM2 阻害剤あるいは細胞内 Ca²⁺ キレート剤により抑制された。次に、TRPM2 KO マウスから分取した CD11b⁺ KCs を用いて解析したところ、無刺激条件における IL-1a, IL-1b ならびに CXCL-2 の各遺伝子の発現量は野生型 CD11b⁺ KCs と同等であった。TRPM2 KO CD11b⁺ KCs をザイモザンで刺激したところ、これら遺伝子の発現上昇が見られたが、野生型 CD11b⁺ KCs の場合と比較すると半分程度の上昇に留まった。
　以上の結果より、マウスのクッパー細胞亜集団のうち、CD11b⁺ KCs では ROS により TRPM2 が活性化することで細胞内 Ca²⁺ 濃度の上昇が起こり、炎症性サイトカイン産生を亢進させることが考えられた。

C-2-5 〇山下 正道 Masamichi Yamashita 日本大・生物資源・食品開発 　我々は、核内受容体 PPARγ リガンドで、糖尿病の治療薬として 用いられていた troglitazone（Tro：0.1〜1 μM）が、ラット由来のマスト細胞様の細胞株である RBL-2H3 の、I 型アレルギーを模した抗 dinitrophenol（DNP） IgE 添加後に抗原（Ag）として DNP-conjugated human serum albumin を添加するモデルにおいて、cysteinyl leukotriene（cysLT＝leukotriene C₄, D₄, E₄）産生を、抗ぜんそく薬で 5-lipoxygenase 阻害薬の Zileuton（0.1〜1 μM）と同程度の強さで抑制することを報告した。
　我々はさらに、カルシウムイオノフォア A23187 で刺激した RBL-2H3 細胞株において、PPARα リガンドの Wy-14,643（Wy：30 μM）および PPARαリガンドで高コレステロール血症の治療薬である fenofibrate（Feno：100 μM）は、cysLT 産生を troglitazone（1 µM）とほぼ同じ強さで抑制した。このとき cysLT 産生抑制作用は Feno, Wy 共にA23187 と同時に添加しても見られず、刺激前に 2 時間の予備培養をおこなうことで見られた。また Wy, Feno 共に、ホスホリパーゼ A₂ 活性の指標とされる、細胞膜からのアラキドン酸遊離を抑制しなかった。
　リアルタイム RT-PCR および Northern blot による検討で、RBL-2H3 細胞株における PPARα の mRNA レベルは ラット肝の 1/1000 程度であった。また Wy, Feno, Tro のいずれも、PPARα を介して発現が調節されると考えられる acyl-CoA oxidase の ｍRNA レベルに影響しなかった。
　さらに、PPARα-null マウス大腿骨の骨髄由来のマスト細胞を I 型アレルギー機序で刺激したところ、wildtype 由来マスト細胞と同様の cysLT 産生抑制作用が見られたため、少なくとも Wy と Feno は PPARα を介することなく cysLT 産生を抑制すると結論した。
　このため、これらの PPARα リガンドの、PPARα を介さない cysLT 産生抑制のメカニズムを明らかにする目的で、RBL-2H3 細胞株における 刺激による cysLT 産生増大に対する Feno の作用について、マイクロアレイを用いる網羅的な mRNA レベル発現解析を実施し、I 型アレルギー機序で刺激した結果について第 98 回 日本薬理学科年会で報告した。今回、A23187で刺激する RBL-2H3 細胞株の cysLT 産生増大に対する Feno の作用について報告する。

C-2-6 〇坂本 謙司、五木田 拓己、恒岡 弥生、森 麻美 Kenji Sakamoto, Takumi Gokita, Yayoi Tsuneoka, Asami Mori 帝京大・薬・医薬品作用 【目的】網膜色素変性は視細胞の進行性の変性脱落を特徴とする疾患であり，この視細胞死には，小胞体ストレスが関与していると考えられている．ツニカマイシンは小胞体ストレスを誘発することが知られており，硝子体内投与すると視細胞特異的な傷害を引き起こす．本研究では，温度感受性チャネルの１つであるtransient receptor potential vanilloid 4（TRPV4）が網膜に発現しているかを検討し，加えてTRPV4選択的刺激薬であるGSK1016790Aがツニカマイシン誘発網膜傷害を抑制するかどうか検討した．
【方法】5〜6週齢のICR系雄性マウスをケタミン（90 mg/kg）・キシラジン（10 mg/kg）混液の腹腔内投与により麻酔し，ツニカマイシン（60 ng/eye）とGSK1016790A（10 nmol/eye）の混液を作製して硝子体内投与した．4日後と7日後に眼球を摘出し，固定後，眼球をパラフィン包埋した．ミクロトームを用いて，視神経乳頭を通る厚さ4 µmの水平切片を作製した．投与4日後の組織切片を用いて，anti-TRPV4 polyclonal antibodyによる免疫組織化学を行った．投与7日後の組織切片をヘマトキシリン・エオシン染色し，視神経乳頭から500 µm離れた部位の網膜50 µmに含まれる視細胞核を計数した．
【結果】TRPV4は，正常ならびにツニカマイシン硝子体内投与4日後の網膜の外網状層，ならびに視細胞外節に発現していた．ツニカマイシン投与7日後の網膜において，視細胞の変性脱落が認められ，この網膜傷害はツニカマイシンとGSK1016790Aを同時に投与することにより有意に抑制された．
【考察】TRPV4刺激は，小胞体ストレスによる網膜傷害を部分的に抑制することが明らかとなった．TRPV4は，27〜35℃の温度だけでなく，機械的刺激やカンナビノイドなどでも活性化される．我々は，以前にカンナビノイドトランスポーターを阻害することが知られているAM404が，カンナビノイド受容体の刺激を介してツニカマイシンにより誘発される網膜傷害を抑制することを報告している．本実験の結果から，AM404の網膜保護作用にはカンナビノイド受容体の刺激だけではなく，TRPV4の刺激も寄与している可能性があり，今後さらなる検討を行う必要がある．