A-1-1 〇野島 秀文¹、鶴田 こむぎ¹、宮岸 寛子¹、南郷 拓嗣¹、阪田 泰子²、石川 英明²、坪井 誠²、小菅 康弘¹ Hidefumi Nojima¹, Komugi Tsuruta¹, Hiroko Miyagishi¹, Hiroshi Nango¹, Yasuko Sakata², Hideaki Ishikawa², Makoto Tsuboi², Yasuhiro Kosuge^{1 1}日本大・薬・薬理、²シー・アクト ¹ 【目的】微細藻類 Aurantiochytorium由来機能性脂質であるペンタデシルは、奇数鎖飽和脂肪酸であるペンタデカン酸を多く含むトリグリセリドである。これまでに、皮膚バリア機能の改善、ヒト線維芽細胞における小胞体ストレス緩和作用、視神経細胞の保護作用などの生理活性が報告されている。しかし、免疫細胞などの炎症性応答に対する作用については不明な点が多い。本研究では、マウスミクログリア細胞株BV-2細胞を用いて、Lipopolysaccharide (LPS) 刺激により誘導される炎症性遺伝子発現に対するペンタデシルの効果を検討した。
【方法】ペンタデシルは、株式会社シー・アクトより提供された。BV-2 細胞は、10% ウシ胎児血清を含む Dulbecco's Modified Eagle's Medium 中で37℃、5%CO₂条件で培養した。ペンタデシルを単独またはLPS (1 μg/mL) と共処置した24時間後の細胞増殖能及び細胞毒性は、それぞれMTT 法またはLIVE/DEAD 法により評価した。また、処置 4 時間後にmRNA発現レベルを Real-time PCR法により評価した。
【結果および考察】ペンタデシル単独処置またはLPSとの共処置はいずれも、BV-2細胞の増殖能に顕著な影響を及ぼさなかった。また、LIVE/DEAD染色において、Ethidium homodimer-1 陽性死細胞や Calcein AM 陽性生細胞の数にも有意な変化は認められなかった。LPSを4時間処置した細胞では、炎症性サイトカイン (IL-6、IL-1β、TNF-α) 及び PGE₂合成酵素 (mPGES-1、COX-2) のmRNA 発現誘導が確認された。ペンタデシルは、LPS による IL-6及びIL-1β の mRNA 発現増加を有意に抑制したが、TNF-α の mRNA 発現増加には影響を及ぼさなかった。さらに、ペンタデシルはLPS により誘導された mPGES-1 のmRNA 発現増加には影響を及ぼさなかったものの、COX-2 のmRNA発現増加は有意に抑制した。以上より、ペンタデシルは、BV-2 細胞において細胞障害性を示すことなく、一部の炎症性サイトカイン及び PGE₂ 合成酵素の発現を抑制する抗炎症作用を有することが示唆された。

A-1-2 〇守屋 玲^1,2、パラジュリ ビージェイ^1,2、繁冨 英治^1,2、小泉 修一^1,2 Akira Moriya^1,2, Bijay Parajuli^1,2, Eiji Shigetomi^1,2, Schuichi Koizumi^{1,2 1}山梨大・院医・薬理、²山梨大・グリアセ ¹ The choroid plexus (ChP), a key interface between the central nervous system and peripheral immune cells, hosts a diverse array of immune cells, with macrophages being the predominant population. Macrophages populate the ChP in two distinct anatomical locations: (1) on the apical surface, where they are directly exposed to CSF, and (2) within the stromal space, where they interact with blood-derived factors. The apically located macrophages, known as epiplexus macrophages (ChPepi macrophages), increase in number under pro-inflammatory conditions, such as infections, and are believed to play roles in immune responses and antigen presentation. Recent transcriptomic studies have identified that ChPepi macrophages, express genes associated with microglia, such as P2RY12 and TMEM119, raising an intriguing possibility: parenchymal microglia may migrate to the ChP, transform into ChPepi-macrophages, and interact with peripheral immune cells to regulate immune responses at brain interface. However, the exact origin of these cells remains unclear. Here, using a syngeneic microglia transplantation approach, we provide direct evidence that microglia transplanted in the brain parenchyma migrate to the ChP, acquire ChPepi macrophage-specific characteristics, and persist within this niche. Furthermore, we identify RARRES-2, a chemokine secreted by ependymal cells, acts on microglial CMKLR1 to promote microglial migration to the ChP via cerebrospinal fluid. Our findings reveal a previously unrecognized mechanism by which CNS-resident microglia contribute to the immune landscape of the ChP, underscoring their potential role in modulating neuroimmune interactions at brain interface through interactions with peripheral immune cells.

A-1-3 〇淺井 健希^1,2、米津 好乃^1,3、三澤 日出巳³、村松 里衣子¹ Taiki Asai^1,2, Yoshino Yonezu^1,3, Hidemi Misawa³, Rieko Muramatsu^{1 1}国立精神・神経医療研究セ 神経研 神経薬理、²明治薬科大・院生命 、³ 慶應義塾大・院薬 薬理 ¹ Lipopolysaccharide (LPS) はグラム陰性菌の細胞壁外膜を構成する糖脂質である。LPSは全身性に炎症を惹起する働きがあり、中枢神経系においても炎症応答を誘導するとともに血液脳関門を破綻させる。血液脳関門は血管内皮細胞により形成されるが、ペリサイトなどの血管周囲細胞がバリア機能の維持に寄与する。このことから、LPSはぺリサイトにも作用し、その機能を変化させる可能性が推察されるが、その実体には不明な点が多い。本研究ではヒト脳初代ぺリサイト培養細胞に対するLPSの作用を検討した。
細胞の挙動に関して、LPSで刺激したぺリサイトはBromodeoxyuridineの取り込みを促進した。LPS刺激によりKi67陽性ぺリサイト数が増加したことから、LPS刺激によりぺリサイトの増殖が促進することが示唆された。一方、細胞の遊走には群間で差が検出されなかった。なお、LPS刺激後にphalloidin染色により可視化した細胞では、細胞分裂との関連が示唆されるaspect比の変動も検出された。分子発現に関して、LPS刺激によるぺリサイトでの遺伝子発現をRNA sequenceにより網羅的に解析し、細胞外マトリックスの産生にアノテーションされる遺伝子群の発現変動を検出した。変動遺伝子に対するpathway解析から、Notchシグナルの変動が抽出された。ぺリサイトは血液脳関門維持のみならず、血管新生や血管の安定化、血流の制御など多様な機能を有する。LPSによる脳ぺリサイトの挙動および分子発現の知見から、ぺリサイトを介した脳血管の機能制御機構の理解につなげていきたい。

A-1-4 〇道永 昌太郎、小川 泰弘、菱沼 滋 Shotaro Michinaga, Yasuhiro Ogawa, Shigeru Hishinuma 明治薬大・薬・薬効 【背景】外傷性脳損傷（TBI）により脳内ではグリア細胞の一種であるアストロサイトの生理活性物質の発現量が変化し、脳機能障害の悪化および抑制に関わる。ヘッジホッグファミリーに属するタンパク質であるソニックヘッジホッグ （Shh）はTBIによりアストロサイトにおいて発現が増加し、血液脳関門の破綻や脳浮腫を抑制する作用があることが明らかとなった。Transient receptor potential vanilloid 4 （TRPV4）は温刺激や機械刺激などにより活性化される陽イオン透過型受容体であり、TBIの病態に関わることが示唆されている。本研究ではアストロサイトのShh発現調節におけるTRPV4の関与を確認した。
【方法】TBIモデルアストロサイトを作製するために、流体衝撃発生装置を使用してddYマウス（2日齢）の大脳より単離した培養アストロサイトに流体衝撃を与えた。Shhの発現変化はReal-time PCR法により確認した。
【結果・考察】流体衝撃を与えた培養アストロサイトにおいてShhのmRNA発現が増加した。この増加はTRPV4阻害薬HC-067047およびRN-1734、TRPV4のノックダウンにより抑制された。また、流体衝撃によるアストロサイトのShh mRNAの発現増加は細胞内カルシウムキレーターBAPTA-AM、protein kinase C （PKC）阻害薬GF109203X、ERK阻害薬SCH772984およびNF-κB阻害薬SN-50によりそれぞれ抑制された。さらに、TRPV4活性化薬GSK1016790Aを処理するとShhのmRNA発現は増加し、この増加もBAPTA-AM、GF109203X、SCH772984およびSN-50との共処理により阻害された。以上の結果より、TBIによるアストロサイトのShh発現増加はTRPV4/Ca²⁺/PKC/ERK/NF-κBを介して誘導されることが示唆され、アストロサイトのTRPV4介したShhの発現増加はTBIに対する脳保護機構であることが推察される。　

A-1-5 〇米村 若奈¹、南郷 拓嗣¹、渋川 義幸²、佐藤 正樹³、宮岸 寛子¹、小菅 康弘¹ Wakana Yonemura¹, Hiroshi Nango¹, Yoshiyuki Shibukawa², Masaki Sato³, Hiroko Miyagishi¹, Yasuhiro Kosuge^{1 1}日本大・薬・薬理、²東歯大・歯・生理、³東歯大・歯・生物 ¹ 【背景・目的】骨格筋の制御を担う運動ニューロン (MN) の神経活動は、主にグルタミン酸を介して調節される。MN研究に広く使用されるマウス由来細胞株NSC-34は、一般的にレチノイン酸 (RA) により分化誘導されるが、グルタミン酸応答性が低いため、MNモデルとしての限界が指摘されている。当研究室はこれまでに、生理活性脂質であるプロスタグランE₂ (PGE₂) が、NSC-34を成熟MNの特性を有する細胞へと分化誘導することを報告している。しかしながら、PGE₂により分化誘導したNSC-34におけるグルタミン酸応答性は不明なままである。本研究では、PGE₂またはRAでMNに分化誘導したNSC-34を用いて、それぞれのグルタミン酸応答性の違いを比較検討した。 【方法】NSC-34は、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で37^oC、5% CO₂条件下で培養した。細胞増殖能はMTT法、神経突起の伸長は位相差顕微鏡像、グルタミン酸刺激による細胞内イオン流入に伴う電流応答の有無はパッチクランプ法、グルタミン酸受容体 (GluR) のmRNA発現はリアルタイムPCR法により評価した。 【結果・考察】PGE₂が細胞増殖と神経突起伸長に及ぼす影響を検討した。PGE₂ (1–100 μM)を48時間処置したところ、30 μMまでは細胞増殖能に影響は認められなかったが、100 μMでは有意に低下した。一方、神経突起を伸長したMN様細胞の割合は、PGE₂ (30 μM) 処置群で最も高く、その割合はRA (10 μM, 7日間) 処置群と同程度であった。PGE₂ (30 μM, 48時間) またはRA (10 μM, 7日間) でMN様に分化誘導した細胞のグルタミン酸 (1 mM) 刺激に対する応答性を評価した結果、PGE₂処理群のみ応答性が認められ、対照群及びRA処理群では認められなかった。そこで、GluRのmRNA発現を検証したところ、Gria2の発現がPGE₂処置群でのみ認められ、対照群及びRA処置群では検出されなかった。一方で、Grin1およびGrin2dは、PGE₂による増加傾向が認められたが、RA処置群との間には有意な差はなかった。以上の結果から、PGE₂により分化誘導されたNSC-34は、Gria2の発現増加を介したグルタミン酸応答性を獲得するため、MNのグルタミン酸応答性を評価する新たなモデル細胞となることが示唆された。

A-1-6 〇佐々木 洸大、並木 繁行、浅沼 大祐、廣瀬 謙造 Kodai Sasaki, Shigeyuki Namiki, Daisuke Asanuma, Kenzo Hirose 東京大・院医・細胞分子薬理学 　発生段階の神経細胞は神経突起を伸長させ、シナプス接着分子を介して他の細胞に接続し、シナプスを形成する。しかしながら、神経の発生・再生過程でのシナプス接着分子の動態についての詳細は明らかになっていない。単一粒子追跡法は、蛍光標識された標的分子を一分子レベルで可視化し、分子の蛍光輝点の位置を経時的に追跡し、その軌跡を解析することで、分子の時空間動態の精密解析が可能である。しかし、広く用いられている遺伝子導入法では、神経突起伸長の初期段階に十分な発現量が得られず、一分子追跡に供することができない。また、一分子追跡では強い励起光によって蛍光色素が退色してしまうため、既存の蛍光標識法では、狭小空間である神経突起内で分子動態の高精度計測に十分な数の軌跡の取得ができない。本研究では、以上の神経突起伸長過程での一分子追跡での技術課題を克服し、シナプス接着分子の時空間動態の高精度解析系の確立を目的とした。
　本研究では、神経細胞で速い蛋白質発現が可能なシンドビスウイルスベクターを採用することで、培養開始後24時間で一分子追跡に十分な発現レベルを神経突起内で得ることができた。
　蛍光色素の退色による蛍光輝点の減少を克服するために、本研究では当研究室独自の蛍光標識技術（DeQODE法）を導入した。DeQODE法では、非蛍光性のリガンドがDeQODEタグと呼ぶ分子タグと結合した際に蛍光性となる。リガンドとタグの結合が可逆的であるため、リガンドの蛍光が退色しても時間依存的にタグから解離し、タグは周辺のリガンドと再度結合し、持続的に蛍光輝点が生じることが期待できる。
　ラット海馬の培養神経細胞に観察前日にシンドビスウイルスベクターによりシナプス接着分子NeurexinとDeQODEタグの融合分子を発現させ、DeQODEタグのリガンド存在下で一分子追跡を行った。その結果、1分間で1µm²あたり0.5軌跡程度の密度で軌跡が取得できた。取得データの平均二乗変位及び拡散係数の解析から、約0.1µm²/sを中央値とする群に加え、約0.01µm²/sを中央値とするマイナーな群を認めた。今後、本解析系をNeurexinの欠失変異体等の神経突起伸長過程での動態解析に適用することで、Neurexinが関わる分子間相互作用の解析や、シナプス形成・再生に介入する創薬標的探索に寄与できると考える。